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Protocolo 01 - Extração de DNA de Sangue Periférico (Técnica de Salting Out)

Publicado em 18/01/2016

- Para realizar a extração de DNA, um volume de 15 mL de sangue periférico coletado em tubo com EDTA é obtido. Os reagentes empregados estão listados no final deste protocolo.

- Resumidamente, diluir 5mL de sangue em 30 mL de tampão de lise de hemácias (1x) em tubo tipo Falcon, manter em gelo por 30 min. A seguir, centrifugar por 15 min. a 2.500 rpm a 4ºC. Descartar o sobrenadante e o sedimento homogeneizado no Vórtex.

- Acrescentar 5mL de tampão de lise de hemácias (1x) e centrifugar a amostra por 5min a 2.500rpm a 4ºC. O Suspender o sedimento em 1,5mL de tampão de lise nuclear (1X), acrescentar de 5 µL de proteinase K (10mg/mL) e 150µL SDS 10% e incubar por 12-16h a 37ºC.

- Adicionar 0,5 mL de NaCl saturado (6M) e centrifugar por 20 min a 3.000 rpm à temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante para novo tubo (tipo Falcon de 15mL) e centrifugar novamente.

- Ao novo sobrenadante adicionar 2 volumes de etanol absoluto para precipitação do DNA. Após a precipitação, remover o DNA, transferi-lo para um microtubo e lavar em etanol 70% à temperatura ambiente. Secar o pellet resultante e solubilizado em 200-400µL de TE por incubação a 65ºC por aproximadamente 2 horas.

- As amostras de DNA assim obtidas podem ser dosadas por espectrofotometria (NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific, por exemplo) a 260nm e sua pureza, aferida pela razão 260/280 nm, para analisar a qualidade do DNA extraído.
Todas as amostras de DNA podem ser estocadas a - 20ºC até o uso.

Soluções para Extração de DNA
1. TBE 5X (Tris-Borato/EDTA)
- Tris ................................................................... 54g
- Ácido Bórico ..................................................... 27,5g
- EDTA 0,5M pH 8,0 .......................................... 20ml
- Água Milli-Q ....................................................... q.s.p. 1000ml

2. EDTA 0,5M pH 8,0
- EDTA dissódico................................................. 37,4g
- Água Milli Q ...................................................... q.s.p 200ml

3. EDTA 0,2M pH 7,4
EDTA 0,5M pH 8,0 ................................................ 40ml
- Acertar o pH.
- Água Milli-Q ....................................................... q.s.p 100ml

4. EDTA 0,2M pH 8,2
- EDTA 0,5M pH 8,0 ........................................... 20ml
- Acertar o pH com NaOH (1N)
- Água Milli-Q .........................................................q.s.p. 50ml

5. Tris – HCl pH 8,0
- Tris base ............................................................ 121,14g
- HCl fumegante .....................................................q.s.p pH 8,0
- Água Milli-Q ..........................................................q.s.p 1000ml

6. Tampão de lise de hemácias (10X)
- Cloreto de amônio (NH4Cl)....................................82,91g
- Bicarbonato de potássio (KHCO3)..........................10,01g
- EDTA 0,2M pH 7,4 ............................................... 50ml
- Água Milli-Q ..........................................................q.s.p 1000ml

7. Tampão de lise nuclear (10X)
- Tris-HCl 1M pH 8,0 ............................................ 20ml
- Cloreto de sódio (NaCl) .........................................46,76g
- EDTA 0,2M pH 8,2 ................................................20ml
- Água Milli-Q ............................................................q.s.p 200ml

8. TE (Tris-EDTA)
- Tris-HCl 1M pH 8,0 ............................................... 1ml
- EDTA 0,2M pH 7,4 .............................................. 0,5ml
- Água Milli-Q ........................................................ q.s.p 100ml

9. Proteinase K (10mg/ml)
- Proteinase K ......................................................... 0,01g
- Água Milli Q autoclavada ...................................... 1ml

10. SDS 10%
- SDS ..........................................................................10g
- Água Milli-Q ..............................................................q.s.p 100ml

11. NaCl saturado (6M)
- Cloreto de sódio (NaCl) .................................................175,2g
- Água Milli-Q ................................................................. q.s.p. 500ml

12. Tampão de amostra (6X)
- Azul de bromofenol ................................................... 0,025g
- Xilenocianol .............................................................. 0,025g
- Glicerol 100% ........................................................... 3g
- Água Milli-Q .............................................................. q.s.p. 10ml

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