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PROTOCOLOS 03 - IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Publicado em 08/06/2016

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

A técnica descrita abaixo é uma das mais frequentes para quem trabalha com microscopia.

Este é um protocolo muito usado em laboratórios de rotina que trabalham com esta técnica.

No final tem os protocolos para as soluções usadas.

Fixação com paraformaldeído
- Lavar as células em PBS para células gelado
- Fixar em p-formaldeído 4% em PBS por 30 min à temperatura ambiente
- Lavar 3 x 5 min com PBS
- Colocar em cloreto de amônio 50 mM em PBS por 15 min
- Lavar em PBS 1 x 5 min
- Manter em PBS a 4ºC até o uso

- No dia da reação permeabilizar em Triton X-100 0,2% em PBS por 15 min à temperatura ambiente
- Lavar em PBS 3 x 5 min
- Bloquear em PGFN por 1 h antes de começar a IFI

IFI
- Diluir os soros primários em PGFN na diluição adequada
- Colocar 50 l do soro diluído sobre parafilme e inverter a lamínula sobre o soro
- Incubar 1 h à temperatura ambiente em câmara úmida
- Lavar 3 x 5 min em PBS
- Diluir o conjugado em PGFN com 1% soro normal de cabra (Amersham)
- Acrescentar bisbenzimida 1:500 (Hoe Calbiochem)
- Colocar 50 µl do conjugado sobre parafilme e inverter a lamínula sobre o conjugado
- Incubar 30 min à temperatura ambiente em câmara úmida
- Lavar 3 x 5 min em PBS
- Montar com glicerina tamponada sobre lâmina de microscopia

- Caso seja IFI dupla incubar cada soro em separado e cada conjugado em separado, colocando bisbenzimida no segundo conjugado

Preparo das soluções
PBS
Na2HPO4 .............. 1,44 g
KH2PO4 ................. 0,24 g
KCL ....................... 0,20 g
NaCl ……………….8,0 g
Dissolver em 800 ml de água destilada. Ajustar o pH para 7,4 com HCl, completar para 1l, distribuir em frascos e autoclavar.

p-formaldeído 4% (Usar marca para microscopia - EMS)
Dissolver p-formaldeído em PBS, aquecendo a 60ºC. Resfriar à temperatura ambiente e acertar o pH para 7,4 com NaOH. Aliquotar e congelar a –20ºC.

Cloreto de amônio 50mM (peso molecular 53,3g)
Pesar 267,45 mg e dissolver em 100 ml de PBS

PGFN (PBS, gelatina de peixe 0,25%, azida sódica 0,1%)
PBS .............................................50 ml
Gelatina de peixe 20% ................ 0,625 ml (Amersham)
Azida sódica 2% ......................... 2,5 ml

Glicerina tamponada com anti-fading
Estoque PHE
fenilenodiamina ................. 50 mg
PBS .................................... 4,9 ml
Acertar pH para 9,0 com NaOH 1N e completar o volume para 5 ml. Aliquotar e guardar a –70ºC. Estável por muitos meses.
Uso – meio de montagem
glicerol .......................... 5 ml (Life- ultra puro)
água dest ..................... 4 ml
PHE estoque .................1 ml

Bisbenzimida (HOE- Calbiochem)
Peso molecular 533,9g
Estoque 0,5 mg/ml (~1mM)
Para uso diluir 1:500

P-formaldeído 4% em HEPES
Aquecer HEPES, dissolver 8 g p-formaldeído em 180 mL do tampão, acertar pH para 7,6 se necessário e completar o volume para 200 mL
Filtrar e manter a -20°C

HEPES 125 mM em H2O DEPC
HEPES mw 238,3
Dissolver 29,812 g em 900 mL H2O DEPC
Acertar para pH 7,6 com NaOH 1N em H2O DEPC

H2O DEPC
Adicionar 0,1 mL de DEPC a 1000mL de água, agitar vigorosamente e deixar repousar 12 h a 37°C. Autoclavar para remover traços de DEPC.


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